近期，国家重点研发计划首席科学家、教育部长江学者特聘教授、岐黄学者张卫东教授带领的海军军医大学团队在Royal Society of Chemistry (RSC advances) 杂志发表题为“An integrated approach for structural characterization of Gui Ling Ji by traveling wave ion mobility mass spectrometry and molecular network”的研究论文，重点研究了28味中药古方龟龄集的药效物质并取得新进展，为中药复方成分研究提供了新的路径。在医药界引起了轰动。本研究开发了一种基于UPLC-TWIMS-QTOF-MS和分子网络的化合物鉴定策略，并成功应用于中药复方龟龄集的结构分类和化学成分鉴定，共鉴定出257个化合物，主要分为皂苷类、黄酮类和磷酸胆碱类化合物。建立的DE-DDA采集方法大大提高了MS/MS数据覆盖率，尤其是对微量成分的表征非常有帮助。通过中性丢失分析和分子网络的结合，20个潜在的新化合物也被快速地发现并进行了结构推测。此外，根据HDMSE数据采集和漂移时间-CCS预测平台区分方法，对30对同分异构体进行了高效且准确的识别。本研究表明，该方法适用于龟龄集中已知、未知化合物和同分异构体的发现和鉴定，其结果对龟龄集的质量控制和体内化学成分研究具有一定的指导意义。同时，这项工作可以作为一个实际的范例，为快速分类和表征复杂样品中多种不同类型的成分提供指导。
中药复方是在中医理论的辨证论治原则指导下，依据单味中药之药性与功效 主治，按照七情合和或君臣佐使等配伍理论形成的组合成方。在中国几千年的历史中，中药复方一直被公认为可有效预防和治疗疾病，具有多成分、多通路和多靶点的特点。然而中药复方成分复杂，运用常规的色谱分离技术研究其化学物质基础耗时耗力，且无法彻底地分离得到中药复方中的所有化合物来完整和系统地体现中药复方化学成分的多样性。龟龄集是一个经典中药古剂，2020年版《中国药典》中记载其是人参、天冬、急性子、甘草、牛膝、补骨脂、淫羊藿、丁香、杜仲、海马、鹿茸、肉苁蓉、地黄、枸杞、菟丝子、锁阳和砂仁等28味单味药组成，具有强身益气和增进食欲的功效。现代药理学研究和临床数据表明，它具有显著的抗衰老、促进生精和提高性激素水平的作用，尤其适用于治疗男性疾病，如早泄、勃起功能障碍和少弱精子症。然而，目前对龟龄集的化学成分研究，仅涉及一种或几种化合物的定性和定量分析方法研究。虽然龟龄集具有显著的临床疗效和药理作用，但因其化学物质基础并不明确，制约了其现代化发展。
研究团队突破性的将分子网络技术应用于龟龄集体外化学成分的研究，并鉴定出257个化合物。本研究使用Waters I-class UPLC-SYNAPT G2-Si HDMS液质联用仪的Fast DDA和HDMSE的采集模式，分别采集龟龄集的DDA数据和离子淌度质谱数据；将DDA数据使用LC-MS/MS分子网络技术对龟龄集中化合物进行快速分类和鉴定，将离子淌度质谱数据与碰撞横截面积(Collision cross sections, CCS)预测平台结合进行龟龄集中同分异构体化合物的区分，从而对龟龄集的化学成分进行了全面系统的表征，有助于阐明龟龄集药效物质基础。同类型的化合物因母核结构相似，常常会产生相同的MS/MS碎片离子，这些化合物因相似的碎片离子信息容易聚集在同一分子网络中。相同的前体离子及其对应相似的MS/MS碎片信息容易在分子网络中生成具有多种颜色的节点。对于每个来源于龟龄集中化合物的节点，它至少包含两种颜色，代表龟龄集中化合物所归属于的单味药来源。因此，基于龟龄集样品的二级质谱数据，创建了龟龄集全体化学成分的总分子网络图（图1）。（图1. 龟龄集化学成分正离子(B)和负离子模式(A)下的总分子网络）
根据上述鉴定策略，从龟龄集中共鉴定了257个化合物（图2），其中237个化合物是通过与自建数据库的初步筛选和文献的进一步比对确定，61个化合物用标准品比对确认。
此外，利用分子网络具有相似性聚类的特征，张卫东教授团队对已知节点相邻的未知节点进行推导与鉴定，初步推测了20个潜在的新化合物的可能的结构，其中包括12个皂苷类化合物和8个黄酮类化合物。（图2. 龟龄集在正离子(B)和负离子模式(A)的总离子流图）
LC-MS/MS分子网络技术有助于龟龄集中微量化合物和未知化合物的鉴定。节点中微量化合物的MS/MS谱图可通过采用DE-DDA采集方法获得，结合各单味药中更高质量的MS/MS谱图，实现对龟龄集中的微量化合物的鉴定。如图3所示，峰198(#807)在龟龄集中呈现低丰度前体离子和少量产物离子，影响了其结构的阐明。由于分子网络数据传递的优势，可以快速确定其单味药来源，而其单味药中的前体离子丰度较高，可以获得更高质量的MS/MS数据。因此，由于获得了单味药到龟龄集的二级质谱信息数据的传递，峰198被确定为甘草皂苷B2。通过相关文献支持与碎片规律的总结，最终，我们从皂苷类化合物的网络簇中共鉴定得到79个皂苷类化合物。（图3. 来源龟龄集和甘草三萜皂苷在负离子模式下的分子网络(A)；节点#807所对应的龟龄集和甘草的一级质谱图(B)；来源甘草的前体离子m/z807.4166的MS/MS谱图(C)；甘草皂苷B2可能的裂解规律(D)。）相同结构类型的化合物非常适合在GNPS平台上进行聚类和识别。皂苷类和黄酮类化合物由于结构相似，很容易聚集到相应的分子网络簇中。以已知化合物开始，相邻的未知化合物节点信息可以通过中性丢失或二级诊断碎片离子来阐明。此外，中药中往往含有大量的同分异构体，这些同分异构体可能表现出多种药理活性，在临床应用中发挥着不可缺少的作用。高度相似的MS/MS数据和相近的保留时间色谱峰，导致同分异构体难以准确区分。我们在常规诊断离子法区分基础上，引入了漂移时间-CCS预测平台区分法作为区分同分异构体的补充。最终，对涉及78个化合物的30对同分异构体进行了区分，其中27个化合物经标准品比对后确认。（图4#1023同分异构体的鉴定：（A）提取的离子色谱（EIC）为m/z 1023.5371[M+HCOO]-，包括20.23min（峰65），22.20min（峰87）和24.16min（峰108）的三个峰，（B）三个峰的MS/MS光谱以及HosenkosideA，B和C的裂解途径，（C）峰65（蓝色）的重叠迁移率分布图，峰值87（橙色）和峰108（绿色），（D）通过CCSbase平台预测了hosenkosideA，B和C的CCS值。）本研究表明，基于UPLC-TWIMS-QTOF-MS和分子网络的化合物鉴定方法，不仅适用于龟龄集中已知、未知化合物和同分异构体的发现和鉴定，其结果对龟龄集的质量控制和体内化学成分研究具有一定的指导意义。与此同时，该研究可作为一个实际的范例，为快速分类和表征复杂样品中多种不同类型的成分提供指导。
